Enzymkinetik og Michaelis-Menten modellen

Du får en grundig teoretisk gennemgang af enzymer og deres virkemåde, samt hvordan man kan opstille et forsøg til at bestemme et enzyms kinetiske parametre Km, Vmax og omdannelseshastigheden K2. Du kommer i laboratoriet og laver forsøget, hvorefter du har et datasæt, der kan bruges til at bestemme de kinetiske parametre.

Hvad går øvelsen ud på?

Du får en grundig teoretisk gennemgang af enzymer og deres virkemåde, samt hvordan man kan opstille et forsøg til at bestemme et enzyms kinetiske parametre Km, Vmax og omdannelseshastigheden K2.

Du kommer i laboratoriet og laver forsøget, hvorefter du har et datasæt, der kan bruges til at bestemme de kinetiske parametre.

I øvelsen ”Enzymkinetik og Michaelis-Menten-modellen” skal du lave et klassisk enzymkinetisk eksperiment. Du skal i forsøget undersøge om enzymet α-galctosidase følger Michaelis-Menten-modellen.

Du skal undersøge hvordan en inhibitor påvirker enzymets reaktionshastighed. Du skal opstille en standardkurve for kendte produktkoncentrationer. Ud fra målingerne kan Michaelis-Menten-modellen, Line Weaver-Burk plot og en standardkurve opstilles hvorfra kinetiske parametre (Km, Vmax, K2) kan beregnes.

Hvordan foregår øvelsen?

På øvelsesdagen får du en grundig teoretisk gennemgang af enzymers virkemåde og hvordan de kinetiske parametre bestemmes eksperimentelt.

Forskellige måder hvorpå enzymer kan inhiberes og deres generelle egenskaber bliver også gennemgået.

Vi undersøger enzymet α-galctosidase og hvordan det påvirkes af inhibitoren galactose. Inden vi går ind i laboratoriet, bliver forsøgsopstillingen gennemgået og der laves beregninger til alle reagenser, der benyttes i forsøget. I laboratoriet skal vi lave reagenserne, til at opstille en standardkurve med forskellige koncentrationer af pNP standardopløsning fortyndet i stopreagens (Na2CO3).

Herefter udføres forsøget med α-galctosidase ved at tilsætte enzymet til en fortyndingsrække af dets substrat pNP-gal (4-Nitrophenyl α-D-galactopyranoside) uden inhibitor. Stopreagens tilsættes efter 30 sekunder for alle reaktionerne. Til sidst udføres forsøget på samme måde som før, men nu med inhibitor (galactose) tilsat. Forsøget opsættes i en microtiter plade i duplikater hvorefter vi, ved brug af et spektrofotometer, måler absorbansen. Absorbansen er et udtryk for hvor meget produkt enzymet omdanner under de to forskellige forhold.

Absorbans-målingerne udgør et datasæt hvorfra Michaelis-Menten-modellen, Line Weaver-Burk plot og en standardkurve kan opstilles. Disse modeller benyttes til at beregne enzymets kinetiske parametre i form af Km værdien og enzymets Vmax samt omdannelseshastigheden K2.

Når forsøget er udført, er der tid til at lave databehandling i Excel. Her opstilles en standard kurce, en Michaelis-Menten kurve, et Line Weaver-Burk plot og vi kan ud fra dette beregne Km, Vmax og K2. 

Hvilke faciliteter kommer du til at bruge?

Du kommer til at arbejde i Eduforce Laboratoriet. Her får du mulighed for at lære, hvordan man opstiller forsøg i microtiterplader. Du lærer at pipettere. Du kommer til at bruge et spektrofotometer til at måle absorbans.

Du får en rundvisning på DTU, hvor du kommer til at se kantinen, biblioteket, S-huset samt en forelæsningssal og et grupperum.

Tilmeldingen til SRP-øvelser 2023 er lukket

Du kan for eksempel redegøre for enzymers opbygning, funktion og metaboliske virke samt en redegørelse for Michaelis-Menten ligningen opfattet som en funktion og denne funktions karakteristika.

Du kan inddrage et selvvalgt enzym, fx α-galctosidase, og redegøre for dennes karakteristika. Du kan redegøre for hvordan Km og Vmax bestemmes samt forklare mindste kvadraters metode, som er den teori, der ligger bag lineær regression.

  • Velkommen
  • Introduktion til øvelsen: teori om enzymer, Michaelis-Menten-modellen, kinetiske parametre
  • Gennemgang af forsøgsopstillingen og beregning af koncentrationer
  • I laboratoriet og lave eksperimentet: standardkurve, forsøg uden inhibitor, forsøg med inhibitor.
  • Fælles frokost
  • Rundvisning på DTU samt oplæg om at studere Life Science på DTU.
  • Databehandling
  • Opsamling og diskussion
  • Evaluering og afslutning
  • Tak for i dag
Du får data med hjem, i form af et datasæt af absorbans målinger af de enzymatiske reaktioner.

Forslag til litteratur, du kan bruge i din opgave og som baggrund for øvelsen:

Du vil med fordel kunne avende litteratur om enzymer og enzymkinetik.

Når du er tilmeldt, modtager du en forsøgsvejledning samt et dokument med forslag til artikler, der kan inddrages.

 

  • Biolgi: Biologi A/B, enzymer, enzymkinetik, protein.
  • Bioteknologi: Bioteknologi A, enzymer, enzymkinetik, protein.
  • Kemi: Kemi A/B, enzymer, enzymkinetik, protein.
Kan kombineres med:
  • Kemi
  • Matematik
  • Kemiske bindingstyper
  • Organisk kemi
  • Enzymer
  • Proteiner
  • Mængdeberegninger
  • Enzymkinetik
  • Enzymkinetiske parametre
  • Michaelis-Menten modellen
  • Line Weaver-Burk plot
  • Lineær regression
  • Mindste kvadraters metode.

Tidspunkt og varighed

  • Fredag den 10. februar kl.9-17
  • Fredag den 17. februar kl. 9-17

Antal deltagere

10

Sprog

Dansk

Opfølgende møde

- hvor du kan du få hjælp til  din databehandling og stille spørgsmål:

  • Torsdag den 2. marts kl.17-18

Arrangør og adresse

DTU Bioengineering
Lyngby Campus

Kontakt

Emma Kjærgaard Danø

Emma Kjærgaard Danø Eduforcekoordinator Institut for Bioteknologi og Biomedicin